高分子物理实验教学中凝胶色谱法常见问题分析
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凝胶渗透色谱 (gel permeation chromatography, GPC) 是一种近几十年才发展起来的新型液体色谱, 由美国学者J.C.Moore 于1964年首先研究成功[1]。GPC的分离原理是基于溶液中分子体积 (流体力学体积) 的大小。GPC接上不同的检测器, 可以同时测定聚合物的各种相对分子质量及其分布, 在食品质量鉴定、农药残留分析以及对生物组织、谷物、植物和环境样品进行净化处理[2]等众多领域中应用广泛。凝胶色谱法是高校实验教学中一种快速的分子量和分子量分布测定法, 被誉为近年来分子量分布测定技术中的一项重要突破。在GPC实验中, 经常会遇到各种问题, 合理分析这些问题, 无疑对本科生教学意义重大。
1建立GPC装置中的问题
品型凝胶色谱仪由输液系统 (包括溶剂贮存器、脱气系统、输液泵、进样器以及各种调节泵、压力表等) 、色谱柱、浓度检测器、分子量检测器以及一些附属电子仪器组成[3]。在本科生实验教学中, 为了培养学生的实际动手能力、鼓励学生积极思考, 在有限的实验室条件下, 我们建立了自组装GPC装置。本套仪器将使本科生对凝胶色谱测分子量及分子量分布的原理和操作有更深层次的理解和掌握, 对扩展实验室的硬件设备和提高高分子物理理论分析水平等方面有相当重大的意义, 并为本科生实验的全面性组建贡献力量。
2凝胶相关问题的分析
凝胶是凝胶色谱的核心, 是产生分离作用的基础。凝胶固定相包括具有确定孔径的有机和无机凝胶两大类。根据凝胶使用的强度性质, 又把凝胶分成软胶、半硬胶和硬胶三大类。常用的凝胶包括硅胶、葡萄糖、丙烯酸酯、聚苯乙烯等。不同的凝胶在性能、使用及装柱方法等方面有着明显的差异。进行凝胶色谱实验时十分重要的一环就是选择和搭配具有不同孔径、色谱性能良好的凝胶。
2.1凝胶类型的选择
在本实验中首先选用了无机多孔硅胶[4], 硅胶粒径通常为5～10 μm。无机多孔硅胶一般为硬胶。硬胶虽然有很多优点, 但是最大的问题在于本身含有残留的活性点, 容易引起吸附效应, 导致分离机里的情况复杂化。吸附效应在凝胶色谱实验中经常出现, 严重的情况是进行实验时, 进样以后试样被完全吸附在色谱柱上得不到分析结果, 一般的现象是使色谱峰有很长的拖尾, 峰尖位置也向后挪动。数值计算时Mw、Mn偏低, Mw、Mn偏大。吸附往往出现在凝胶有极性基团。为了应尽可能消除吸附等副作用, 本实验使用的多孔硅胶是经由厂家表面处理过的, 尽管如此, 实验中发现峰拖尾现象还是很严重, 其中吸附效应无疑是主要的影响因素。
2.2凝胶的选择指标
除了要求有良好的化学稳定性和热稳定性、有一定的机械强度、不易变形、流动阻力小和对试样的吸附作用较小外, 更要求载体的分离范围越大越好。分离范围是指V0和V0+Vi 2个淋出体积在分子量淋出体积曲线中对应的分子量之间的值, 它取决于载体的孔径分布。孔径分布越宽, 则分离范围也越宽[5]。为了加宽分离范围, 可以用不同孔径分布的载体混合装柱, 或将装有不同规格载体的色谱柱串联使用。所以进行改进实验时, 选择2种孔径的载体凝胶, 分别为以上所提到的无机硅胶和交联聚苯乙烯凝胶 (粒度在10 μm) , 大大增加了色谱柱的分离范围。混合使用时, 二者的混合比例则会成为影响分离效果和柱效的关键点, 所以要针对2种凝胶混合比例进行讨论。通过这样的延伸实验, 使学生真正开动脑筋去思考, 同时加强对知识更深层次的理解。
3色谱柱技术问题的讨论
高效的色谱柱作为凝胶色谱法的心脏, 最重要的指导原则就是:色谱柱应装填得尽可能均匀和紧密, 在柱中没有裂缝或沟槽, 也不发生柱的径向或轴向凝胶的粒度不均匀分布。所以在色谱柱问题上, 不同的装柱方法、装柱高度和装柱比例都会对色谱柱的整体性能和分离能力产生很大的影响。针对实际的柱子情况, 对这3点进行了讨论。
3.1色谱柱材质的选择
色谱柱的材质可以采用玻璃或不锈钢, 根据不同用途和所要求的力学承载力决定[6]。工业应用中常采用不锈钢材质的色谱柱, 而在实验室中不需要很高的力学承载力, 因此常用玻璃的色谱柱。本校实验定制的色谱柱是长约1.5 m的双层玻璃管, 其中内管为实验发生部分, 柱内壁均匀光滑, 内外管之间的空隙是为恒温水浴设计的, 以避免外界环境温度对柱效的影响。色谱柱上下均为14 mm标准口径, 为增加其他配件提供了方便之处, 且玻璃透明, 能够直观地看到内管中凝胶的装载情况, 发现装柱的问题 (有无空气空隙、有无明显的密度梯度突变等) , 方便学生观察理解。
3.2装柱方法的探讨
色谱柱的装填可以分为干法装柱和湿 (浆) 法装柱2种[7], 在实验中对2种装柱方法均进行了尝试, 以下为2种方法的装柱过程和装柱效果对比。
(1) 湿 (浆) 法装柱。
观察玻璃内管中凝胶的装柱情况。柱中多次填装的凝胶, 段与段间有明显的空隙和断层, 观察到颜色深浅不一, 说明整体的密度不均, 效果不是很理想。可能由于凝胶的粒度过细且没有高速匀浆法那样的高压强, 所以凝胶在溶剂中不易沉降, 在不同段之间产生密度梯度, 使整个色谱柱中凝胶松紧不一而影响柱效。
(2) 干法多次装柱。
凝胶填装完成后, 可以看到每次装柱段间仍有明显的间隙和断层, 加入溶剂后, 段与段之间界面的差异更加明显, 干法多次装柱失败。
(3) 干法一次装柱。
不进行阶段性敲打, 装柱凝胶到达指定高度后, 一次性轻扣1 000次以上, 注意用力均匀, 然后用溶剂淋洗直至柱内空气排空。观察装柱效果, 肉眼看, 柱内无明显断层和间隙, 且颜色均一, 证明密度较均匀。
对比以上3种装柱方法, 决定应用干法一次装柱法作为实验的装柱方法。
在装柱时, 切记不能使用机械振动的办法, 因为横向振动将会引起玻璃管内凝胶粒度分离, 大颗粒将聚集在柱壁周围, 而小颗粒将聚集在柱的中央。粒度分离必将导致凝胶的不均匀堆积, 引起峰加宽效应的加剧, 降低灵敏度。在加料和叩实的过程中用适当的棍条把凝胶压实, 如果用力得当, 能使凝胶装实而不致引起粒度分离, 效果会更好。
3.3装柱高度的确定
凝胶在内层内的高度对分离的效果和色谱柱实验可行性的影响都是需要讨论的内容。对于色谱柱的分离效果, 经验告诉我们, 柱越高, 分离效果越好, 但实际情况是, 由于本实验没有加压装置, 故溶液下滴的速度完全依赖凝胶对其的阻力而变化。不难想像, 柱越高, 溶液经过的路径阻力就越大, 测量需要的时间越长, 所以在装柱高度和实验可行性之间有一个平衡点。虽然柱的高度越高分离效果越好, 但同时拖尾现象也越严重, 主要原因前面已经陈述过 (吸附效应等副反应) , 且溶剂的淋洗速度也随柱高的增加而变慢。为了使设计更加人性化, 更加合理化, 同时也要考虑到玻璃管的力学承载能力。实验中对可行性也进行了探讨。需要设置不同装柱高度的色谱柱进行实验, 根据所得的结果进行选择, 综合各方面考虑, 最终确定一个比较合适的高度。
4溶剂的相关问题
4.1溶剂的选择
进行实验前, 首要的工作是选择合适的溶剂。选用原则如下:
(1) 实验工作者需要处理和接触大量的溶剂, 因此要求溶剂毒性低、易纯化、化学性质稳定;
(2) 溶剂应对样品有很好的溶解能力, 最好是能够溶解多种聚合物, 避免改变分析对象时更换溶剂, 尤其对于难溶的高分子样品, 应使其充分溶解, 才能获得良好的分离效果;
(3) 溶剂的黏度要尽可能小, 以减小流动阻力, 避免影响色谱淋洗速度, 因为在给定的线速度下, 色谱柱的压降正比于溶剂的黏度;
(4) 溶剂的溶点要在室温以下, 沸点要高于实验温度30°以上, 若沸点温度较低, 有时在色谱柱中会产生气泡, 干扰实验结果;
(5) 为了保证比较高的检测灵敏度, 溶剂还应与各种检测器相匹配, 如果用示差折光仪检测, 要求溶剂折光指数与被测试样的折光指数有尽可能大的差别相差, 溶剂挥发量过大影响分光光度计的稳定性, 基线有较大波动, 即所谓的漂移现象, 影响实验精度;
(6) 溶剂流动相应与柱中填充的凝胶固定相相互匹配, 能够很好地浸润凝胶, 可以有效地防止凝胶的吸附作用 (当采用软质凝胶时, 溶剂应能使凝胶溶胀) 。
4.2溶剂的过滤
几乎所有的溶剂在进行实验前都必须使用0.45 μm (或0.22 μm) 滤膜过滤, 除去杂质微粒。因为杂质的存在, 可能导致柱效的降低。
4.3溶剂的贮存
溶剂一般贮存在玻璃、聚四氟乙烯或不锈钢的容器内, 而不贮存在塑料的容器内。因为在GPC测试中, 很多时候使用有机溶剂。有机溶剂可能浸出塑料中的增塑剂, 导致溶剂本身被污染。容器应定期清洗, 以除去由于时间过长可能生长出的微生物。
综合以上各方面的问题[8], 我们选用目前凝胶色谱中最常用的四氢呋喃为溶剂。四氢呋喃是很多塑料的良溶剂, 甚至是θ溶剂。淋出体积没有浓度依赖性, 那么就可以消除由于浓度依赖性而增加的实验工作量。本实验中也选用四氢呋喃。四氢呋喃虽然是一个较理想的凝胶色谱用溶剂, 但是四氢呋喃贮存过程中, 尤其在光照条件下很容易生成过氧化物, 所以四氢呋喃要避光保存, 且使用前要纯化。
5溶质的相关问题
5.1溶质样品浓度
色谱图有浓度依赖性, 当浓度增加时, 色谱图的峰值将移向较高的淋出体积值, 浓度继续增加时, 色谱图会发生变形和拖尾。因此要得到准确的分子量分布和平均分子量, 进样浓度应保持尽可能低, 否则需要将数据向无限稀释外推。凝胶色谱操作在低浓度范围时, 输出信号与浓度呈线性关系, 不需对响应曲线作修正就能计算, 否则则不满足线性关系, 需进行修正校订[9]。有的研究者曾采用GPC (凝胶渗透色谱) 测定了MBS/PVC 共聚树脂中PVC 的相对分子质量及其分布, 考察了样品质量浓度在0.05～0.4 mg/mL 之间时浓度的变化对测定结果的影响。实验结果表明:在低浓度范围内, 随着样品浓度的增加, 测得的相对分子质量逐渐减小, 分布逐渐变宽[10]。
5.2溶质样品的溶解时间
在相同的实验条件下进样分析, 发现不同溶解时间的GPC 色谱图不同。溶解时间长时, 测得的数均相对分子质量、重均相对分子质量、黏均相对分子质量都要比溶解时间短时要大, 相对分子质量分布窄。从而说明, 采用GPC 法测定聚合物相对分子质量及其分布的结果与溶剂溶解时间有关, 溶解时间越长, 测得的相对分子质量越大, 这可能是由于溶解时间的延长使得大分子链充分伸展了。
5.3柱温对实验结果的影响
外部环境的温度可能对实验结果造成一定的影响, 所以为了减少其影响, 最好将仪器放置在高于环境温度的恒温环境中, 即保持柱温不变[11]。柱温不同, 柱效也是有区别的, 随着柱温的升高, 柱效有一定程度的提高。原因可能是柱温升高会使凝胶溶胀充分, 聚合物分子在溶剂中良好地溶解, 凝胶的吸附效应减少, 溶剂黏度降低, 试样的扩散速度增加。但是实验室教学条件有限, 实验在室温下进行操作, 由于室温不是恒定不变的, 所以对结果会造成一定的影响。
6结束语
液相凝胶色谱和任何一种常用的分析方法一样, 都不是十全十美的, 也有它自己的局限性, 最主要的缺点是它的峰容量较小以及不能分离具有相同或非常相似大小的分子, 且缺少通用型检测器。这些缺点随着高效凝胶填料的出现而逐渐得到一定程度的弥补。凝胶色谱法对于解决实际分析的问题仍需要我们继续探索。
