凝胶渗透色谱在高聚物分子量测定中的应用
发布时间：2020-09-12作者：lht来源：点击：次
凝胶渗透色谱 (GPC) , 是液相色谱的分支, 是表征高聚物的重要方法之一。通过GPC测试, 可以得到高聚物的相对分子量和分子量分布。GPC分离的基本机理是体积排除。假设被分析的高聚物在溶液中呈无规线团状, 在淋洗液作用下, 无规线团在凝胶中运动。线团的体积大小不同, 其在凝胶中的运动时间就不同, 尺寸大的在大孔或凝胶空隙间运动;尺寸小的分子由于体积小, 既可以在大孔中运动, 也可以在小孔中运动。结果是高分子量的物质淋洗时间短, 低分子量的淋洗时间长, 溶剂类小分子最后流出。
需强调的是, 体积排除是理想状态下的分离机理[1]。在这种状态下, 高聚物的线团尺寸是GPC分离的决定性因素, 且完全忽略高分子线团和固定相之间以及高分子线团和溶剂之间的相互作用。满足这种机理的凝胶本身只能为非极性或弱极性的材料, 常用苯乙烯和二乙烯基苯聚合而成。在合成凝胶的过程中加入各种制孔剂来控制其孔径大小和孔隙率, 所用淋洗液为弱极性的甲苯或四氢呋喃 (THF) 。以THF为淋洗液可以测定的高聚物种类最多, 如聚苯乙烯、苯乙烯共聚物、聚氯乙烯等。
除了体积排除机理, GPC还有次级分离机理。这种机理中, 分子尺寸并不是唯一的决定因素, 其他外界因素, 如高分子的极性、带电与否、淋洗液的极性和淋洗液的组成等, 也影响分子量的测定结果。当淋洗液以水为主成分时, 高分子溶质与填料之间还有可能存在复杂的相互作用:氢键相互作用、疏水相互作用、极性相互作用和离子与离子之间的相互作用。
高聚物在色谱柱中受到淋洗液作用而流出时, 有时为单一的体积排除, 有时兼有体积排除和非体积排除双重机理。若非体积排除作用超过体积排除时, 高聚物违背按体积大小进行洗脱的原则, 将获得错误的分子量数值;或者高聚物吸附在固定相表面, 产生不了信号, 得不到分子量的数值。在以极性淋洗液进行GPC分析时, 要依据色谱柱的填料基团、高分子的链接单元及其电荷情况设法抑制不利因素的影响。
本文综述了凝胶色谱及其联用技术的最新进展情况。譬如分子中含有亲水基团的油溶性高分子的直接测定[2,3,4]、高分子衍生化后的测定[5,6]、将光散射检测器和示差检测器联用测定蛋白质的重均分子量、均方根半径、Mark-Houwink方程中的K, α值[7];GPC与红外检测器联用研究丙烯和1-丁烯共聚物的组成[8];GPC与粘度及多角度光散射检测器联用研究乙烯与醋酸乙烯酯共聚物中长、短支链之间的相互作用、以及定量分析长、短支链的分布情况[9]。
1 GPC的应用
1.1 油溶性聚合物分子量的测定
分子中不含亲水性链段的油溶性聚合物, 用THF测定容易实施, 结果也令人满意, 常见的有聚乳酸、聚氯乙烯和聚苯乙烯等;若分子中存在亲水性基团, 如聚合物的端基或者支链含有羧基, 且该基团对整个高聚物的淋洗体积影响可以忽略, 也可以用THF直接测定。当亲水性基团对淋洗体积的影响较大时, 须向THF中加入适当的抑制剂后进行测定。如苯乙烯和衣康酸共聚物的测定中[2], 需在THF中加入高纯度且体积比为10%乙酸为淋洗液。只要乙酸的添加体积不超过10%, 则标准曲线中聚苯乙烯的淋出体积不随乙酸的加入而改变, 其对实验结果的影响可以忽略。Luo等[3]在测定苯乙烯和丙烯酸的共聚物时, 在淋洗液中加入2 (wt) %的1 mol/L盐酸来抑制分子中的羧基和柱填料内表面极性基团的相互作用。尽管新启用的色谱柱内表面没有强极性基团, 但使用一段时间后, 极少量存在于THF中的过氧化物会氧化色谱柱表面, 产生羟基或羧基等。
研究发现, 直接用THF测定一些含氮原子的高聚物结果难以令人满意。在淋洗液中加入适宜的含氮小分子, 可以抑制固定相的吸附作用。例如, 在测定环氧乙烷与聚N-异丙基丙烯酰胺的接枝共聚物时[4], 向THF中加入1% (体积比) 的N, N, N’, N’-四甲基乙二胺, 可以有效抑制吸附, 获得较准确的分子量。
在非极性高聚物的测定中, 除了添加醋酸、盐酸外, 还可在THF中混合其他强极性的溶剂, 如甲醇、乙腈、DMF和DMSO进行测定。一方面, 强极性溶剂与THF的混合, 可提高待测物的溶解度, 方便测试;另一方面, 加入良溶剂后, 溶质的优先溶剂化可能会影响分析结果准确性。因此, 对测定中混入适当强极性溶剂作为淋洗液的情况应引起足够注意。
当强极性基团、单体单元或链节存在于高分子链上而不能直接测定时, 可用衍生化方法处理。Chaduc等[5,6]用三甲基硅烷化重氮甲烷将分子链中的羧基衍生为酯基, 以THF为淋洗液直接测定了高分子的分子量。Jacquire等[10]先用碘甲烷对聚合物进行处理, 削弱羧基和柱填料的相互作用, 再以THF为溶剂测定了丙烯酸丁酯和丙烯酸的嵌段共聚物的分子量。
高支化度的聚酯在THF中溶解度差, 难以直接进行测定, 用衍生化方式处理高分子链段上的羟基、胺基或羧基后就可以用THF直接测定。例如, 向1m L浓度为0.3% (质量体积比) 的聚酯的THF溶液中[11], 加入20μL N-甲基咪唑溶液为催化剂, 再加入适量乙酸酐后于室温下搅拌1 h, 然后进行分析;而对于羧基含量较高的高聚物, 可以用N, O-双 (三甲基硅基) 三氟化乙酰胺衍生化处理。将0.3m L硅烷化试剂滴加到3m L含0.3% (质量体积比) 高聚物的THF中, 60℃搅拌3h, 过滤后直接测定。
1.2 水溶性聚合物分子量的测定
1.2.1 影响水溶性聚合物分子量的测定因素
影响水溶性聚合物淋洗体积的主要因素有氢键、离子交换、离子排斥和疏水相互作用[12,13]。
高聚物吸附于固定相上的原因较多, 氢键是其中的主要因素之一。在水溶性高聚物的测定中, 客观上要求测定的高聚物和孔表面的基团之间有一定的亲和力, 因此选用制备凝胶的单体带有一定的亲水基团。目前, 水性柱凝胶的常用单体为甲基丙烯酸β-羟乙酯, 交联剂为二甲基丙烯酸乙二醇酯。聚合得到的固定相的凝胶孔径管腔内表面有亲水性的羟基存在, 而凝胶骨架本身又是疏水性的。
若被测高聚物含有羟基、胺基、巯基和硫羰基时, 这些基团与固定相的羟基之间产生氢键作用, 使得高聚物与固定相之间出现吸附现象。氢键的作用将拖延高聚物溶质在色谱柱中的运动, 使得分子量测定值变小。吸附严重时, 样品的淋洗体积大于溶剂淋洗体积, 无法得到测定数值。因此, 常将尿素、乙二醇、低分子量的聚乙二醇等加入到淋洗液中, 以抑制氢键作用;吸附作用严重时, 可在淋洗液中直接加入需测定的物质进行测定[14]。
静电作用包括静电吸引和静电排斥。当高分子电解质的净电荷不为零时, 易同色谱柱所带的电荷发生相互作用。作用的大小与所带的电荷量密切相关, 电荷量越大, 则吸引或排斥作用越强。理论上讲, 静电吸引作用使得分子量测定值变小, 静电排斥作用使得测定值变大。调节淋洗液p H、加入适量的盐可以消减静电作用。
实际上, 高分子聚电解质本身的分子尺寸也受淋洗液盐浓度或p H影响[15]。当淋洗液中的盐浓度较低时, 高分子呈伸展构象;浓度增加后, 逐渐转变成无规线团。磷酸盐缓冲液具有较宽的缓冲范围, 常常是淋洗液的首选。最为理想的淋洗液应保证高分子在其中呈现无规线团状, 所带静电荷为最少或为零, 且不与固定相之间发生相互作用。因此, 淋洗液的配比是一个复杂的系统工作, 要从实践和理论上不断探索, 得到一个满意的结果。
离子包容和离子排斥作用对分子量的测定也有一定的影响。离子包容使得分子量的测定值偏低, 离子排斥使得分子量的测定值偏高。提高淋洗液离子强度可以减弱这两种因素对分子量测定的影响[16], 但盐浓度超过0.5mol/L时, 色谱柱的柱压增加, 柱效降低, 同时色谱柱的寿命缩短。适宜的盐浓度为0.1~0.5mol/L。
此外, 当高分子溶质和柱填料之间存在较强的疏水相互作用时, 被测高分子无法或者难以进入适当大小的凝胶孔中, 导致测定的结果偏高。如水溶性聚苯乙烯磺酸钠, 其分子骨架为疏水性, 与凝胶本身的疏水性骨架作用强烈, 淋洗液为水时测定存在较大的误差。在淋洗液中添加适量乙腈可以抑制这种作用。根据不同的高分子, 可以在水溶性的淋洗液中添加适量乙腈、甲醇或THF来消除被测定高分子疏水基团与色谱柱之间的疏水相互作用。
1.2.2 GPC在水溶性聚合物分子量测试中的应用
刘小兵等[17,18]以线性聚环氧乙烷 (PEO) 为标准, 用0.05mol/L碳酸氢钠和0.1mol/L硝酸钠缓冲液为淋洗液, 用Waters公司的UltrahydrogelOH色谱柱, 调节流速为1.0m L/min, 测定了聚丙烯酸钠的分子量。有研究者[19]在二甲基乙酰胺中加入0.03% (质量体积比) 的Li Br和0.05 (wt) %的2, 6-二叔丁基-4-甲基苯酚为淋洗液, 在50℃条件下测定聚丙烯酸钠的分子量。
刘瑞鹏等[20]在测定聚乙烯亚胺的分子量时, 串联PL aqagel-OH 20、PL aqagel-OH 30和PL aqagel-OH 40三根色谱柱, 用0.2~0.3 mol/L、p H4.5~6.0的乙酸-乙酸钠溶液为淋洗液, 系统考察了不同的离子强度和p H对聚乙烯亚胺分离效果的影响。结果发现, 提高淋洗液的离子强度, 聚乙烯亚胺在色谱柱上的吸附减小;并且, 溶液的p H也影响聚乙烯亚胺的吸附性, 且比盐的影响更大。改性后的聚乙烯亚胺[21]的测定条件与上述不同, p H更小, 为2.8。这很可能是低p H条件能更加有效抑制氮原子的配位作用。
若存在多种影响因素时, 应该进行综合考量来调整淋洗液。例如聚膦腈 (PCPP, 结构见图式1) 分子支链中既有亲水的羧基, 又有疏水性的苯环, 主链中又含氮和磷元素。淋洗液以水为主, 考虑到羧基的电离, 需加入适量的盐, 可以选用p H 7.4磷酸缓冲液/0.56mol/L的氯化钠进行测定[22,23]。而在他们后续的报道中[24,25,26], 在相同p H下加入一定量的乙腈, 可消除高分子与凝胶柱的疏水作用, 得到了更满意的分子量测定结果。
图式1 PCPP、PNIPAM和PDEA的结构示意图Scheme 1 Structure diagram of PCPP, PNIPMA and PDEA
对于温度敏感高分子, 测试温度是最重要的测试条件之一。例如, 在最低临界溶解温度以上时, 聚N-异丙基丙烯酰胺 (PNIPAM) 和聚N, N-二乙基丙烯酰胺 (PDEA) [27,28,29]线团尺寸变大, 因此, 该类温敏高分子的测定温度要低于最低临界溶解温度。Schilli等[30]在测定最低临界溶解温度为35℃的PNIPAM与丙烯酸的共聚物时, 将测试温度设定为25℃, 有效避免了线团变大带来的影响。
除了测定分子量, 凝胶色谱技术也可用在高聚物的纯化和制备过程中[10]。实验发现, 当用p H 9.0的0.1mol/L硝酸钠作为淋洗液时, 聚丙烯酸钠在色谱柱上存在严重吸附。在制备苯乙烯与丙烯酸钠的共聚物时, 用淋洗液可将合成共聚物的过程中产生的聚丙烯酸有效分离;若以THF/H2O体积比90/10为淋洗液[10], 可以有效分离均聚型的丙烯酸正丁酯和丙烯酸, 而得到丙烯酸正丁酯和丙烯酸的嵌段共聚物。
高聚物在色谱柱中运动时, 多种因素影响着测定结果的准确性。可以采用下述方法判断高分子是否存在相互作用:不同进样量下的峰面积比与进样量的比值, 两个数值越接近, 则相互作用越小;同样进样量下, 连接色谱柱和不连接色谱柱的峰面积大小, 两个数值越接近, 则淋洗液越合理;其次, 色谱峰形状也是重要的判断依据, 测试中色谱峰呈高斯型分布的, 其吸附的可能性小。
2 凝胶色谱联用技术
2.1 紫外和示差联用仪
当凝胶色谱柱的末端串连两种检测器时, 该仪器的功能大大拓展。仪器不仅可以得到聚合物的分子量, 还可以确定高分子的嵌段效率[31]。例如, 在用两步法合成苯乙烯和丙烯酸丁酯的嵌段共聚物时, 可以先合成末端带有硫酯基的聚苯乙烯, 随后将丙烯酸丁酯嵌段上去, 反应结束后得到苯乙烯和丙烯酸丁酯的嵌段共聚物与丙烯酸丁酯均聚物的混合物。均聚的聚丙烯酸丁酯分子中没有硫酯键, 在300nm处无紫外吸收。示差检测信号与高分子浓度成正比, 而紫外信号与含有硫酯的高聚物浓度也成正比, 若以log M为横坐标, d W/log M为纵坐标, 归一化处理两种检测器所得谱图, 谱图重叠程度越大, 则嵌段效率越高。
2.2 示差和光散射联用仪
在GPC上配备示差折光-光散射检测器后, 可以获得高聚物的更多信息[32,33]。只要一个已知示差折光指数增量的标准物质, 就可以在不绘制标准曲线的情况下测定高聚物的重均分子量 (Mw) 和分子量分布, 还可以得到Mark-Houwink方程中的K和α参数值。
刘承国等[32]对测定的原理给出了详实阐述。首先对已知准确浓度、Mw和折光指数增量 (dn/dc) 的标准物质进行测试, 得到仪器常数;然后在同样的条件下对未知物进行测定, 得到未知物折光指数增量。利用光散射ZIMM图的多角度或两角度 (两个点) 计算处理, 可得到未知物的峰均分子量 (Mp) 、数均分子量 (Mn) 、Mw、Z均分子量 (Mz) 及其分子量分布。当然, 用多角度 (双角) -示差法进行测量时, 分子量不能太小, 分子量太小, 散射信号太弱, 将会影响测量结果。
Li等[33]用示差和光散射检测器联用技术成功测定了疏水改性的羟乙基纤维素的分子量, 测试温度为30℃。结果表明, 在淋洗液中加入β-环糊精能抑制纤维素与固定相之间的疏水作用, 从而较为准确地测定了改性纤维素的分子量。
在示差-光散射联用仪中, 标准物质的示差折光指数值参与未知物分子量的计算。不同条件下, 同一标准物质折光指数增量存在差异。同一个标准物质, 在不同的测定条件下, 得到的仪器常数也存在较大差异。因此, 未知物的分析条件应与获得仪器常数的条件完全一致, 否则会带来较大误差。这些条件包括淋洗液流速、色谱柱类型、数量、测试温度、测定的淋洗液组成和淋洗液的p H等。
测定仪器常数时, 不仅要考虑标准物质结构和溶解性, 还要考虑其分子量的大小。标准物质的结构和性质与待测定物质的越相似, 则测定准确度越高。分子量小的标准物质产生的散射光太弱, 得到的仪器常数偏差较大。适宜的分子量在200k Da左右。
此外, 示差折光-多角度联用仪还可以对混合物的各组分进行定量分析。刘承果等[34]将非浓度敏感性光散射检测器用于定量分析, 成功分析了二元共混体系两组分的含量。该方法比用示差检测器更加方便。
3 分子量的标定和校准技术
3.1 仪器校准
分子量的大小不同, 标定方法也各异[2,35]。低分子量可以用高分辨的质谱仪进行测定;能在甲醇中雾化的单分散齐聚物可采用质谱仪标定分子量[36], 分子量不能超过高分辨质谱仪分子量测定上限 (4000Da) ;分子量较大时, 主要用激光光散射法进行标定, 要求样品单分散指数低。
核磁共振氢谱可以用来测定某些高聚物分子量的大小, 有时也可以与其他方法所得的数据互相验证。在用核磁谱图测定分子量时, 要确保高聚物在氘代溶剂中良好溶解性和适宜的浓度。分子量测定的基本原理基于不同类氢原子的个数比等于其积分面积比。在实际计算时, 高分子链中某类氢原子的个数是一定的, 也是已知的;另一类氢原子的化学位移是确定的, 且不与前者化学位移产生干扰, 其积分面积也可获得, 再通过一定的换算就可大概估计高聚物的分子量。如Luo等[3]用核磁氢谱测得PAA28-g-PSt5的数均分子量为2886Da。同样, 测定聚乙二醇嵌段聚甲基丙烯酸甲酯共聚物的分子量时, 如果聚乙二醇的分子量确定, 则可以用核磁共振氢谱得到整个共聚物的分子量。分子量增加到一定程度后, 高聚物的溶解性变差, 谱峰变宽, 积分面积会出现较大误差, 此时估算的分子量意义不大。
3.2 标准曲线校准
用标准曲线法 (多点法) 进行测定时, 标准品的选择也是一个极其重要的问题。标准物质的选用以极性和结构相似为原则。选用的标准物质类别不同, 得到的分子量不同。由于受制备过程的限制, 能作为标准物质的样品不多。一般在油溶性的物质测定中, 选用聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯;在水溶性高聚物测定中, 选用聚环氧乙烷[37]、聚乙二醇[38]、葡聚糖[39]和蛋白质[40]等。
标准曲线法假定具有相同淋洗体积的高聚物的分子量相同, 但实际并非如此, 特别是分子结构不同时。例如, 用聚苯乙烯作为标准物质测定聚乳酸的分子量, 得到的将不是聚乳酸的真实值, 因此可以说标准曲线得到的是相对分子量, 只有经过普适校准[41], 才能得到聚乳酸的真实分子量。
3.3 普适校准
在凝胶色谱的测定中, 有时难以获得待测样满意的标准物质。要得到该物质的分子量的真实值, 只有用普适校准的方法。依据Flory-Fox方程,
其中, [η]为高分子的特性粘度, M为高分子的分子量, rg为根均方半径, Φ为常数。将 (1) 式变形得到:
[η]M成为线团体积的函数, 我们记做f (V) 。将Mark-Houwink方程η=KMα代入 (2) 式, 得到:
此式说明具有相同淋洗体积的不同高分子的KMα+1数值相同。大量的实践也证明, 具有相同淋洗体积的不同高分子流体力学体积相等, 假定用已知高分子的标准物质来测定未知物质, 依据 (3) 式, 可以有公式 (4) :
式 (4) 中, 下标s、p分别代表标准物和待测高分子, K、α是Mark-Houwink方程中的参数。若标准高分子的重均分子量Ms与其Ks、αs值已知, 且待测高聚物的Kp、αp也可以得到, 依据上式就可以测定聚合物的真实分子量Mp。
只有非离子性的高分子才可以用普适校准的方法进行分子量的测定。测定选用的溶剂一般是THF、氯仿、邻二氯苯和甲苯, 且标准和待测物质K、α均要求在完全相同条件下得到。当待测样品在色谱柱的分离过程中存在次级分离机理时, 不能采用普适校准方法。
4 结语
目前, 采用GPC测试油溶性线型高聚物的分子量及分布已相对成熟, 油溶性的支化高聚物的测试还有待于进一步研究和探索[42];水溶性高聚物的测试仍没有一个完善的理论来指导。双亲性高聚物的测定也是一个棘手的课题, 譬如对油溶性的丙烯酸与丙烯酸丁酯的嵌段共聚物, 当丙烯酸单元数目为多少时, 其对分子量测定的影响可以忽略;反之, 对水溶性的丙烯酸与丙烯酸丁酯的嵌段共聚物, 当聚丙烯酸丁酯的分子量为多少时, 不影响整个分子量的测定。此外, 随着新型材料的不断涌现, 具有特定构造的聚合物如树枝状聚合物和星状聚合物不断出现。由于这类聚合物分子具有更加类似球形的紧凑结构, 导致该类聚合物分子量的测定值偏低。该类分子最好采用示差及光散射检测器联用或者采用静态光散射的方法测定分子量。当高分子在溶液中以囊泡状、草莓型或哑铃型等形态存在时, 究竟采用何种方法测定, 还需要科研工作者不懈的探索和努力。
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